Гистофотометрический профиль роговичной реакции при кратковременном действии ортокератологических линз реверсной геометрии на роговице приматов

(Перевод основных разделов. С оригинальной статьей, рисунками и списком литературы можно ознакомиться здесь).

Histomorphometric Profile of the Corneal Response

to Short-term Reverse-geometry Orthokeratology

Lens Wear in Primate Corneas

A Pilot Study

Pike-See Cheah, BSc (Hons), * ‡ Mohidin Norhani, PhD, † Mohd-Ali Bariah, PhD, †

Maung Myint, MBBS, MMedSci, * Munn Sann Lye, MBBS, MPH, DrPH, §

and Abdul Latiff Azian, MD, PhD *

(Cornea 2008, 27: 461-470)

Цель: Исследовать связанные с кратковременным применением ночной ортокератологии (ОК) гистологические изменения роговицы примата.

Методы: Девять взрослых приматов. Один принимал участие как контрольный случай. Остальные восемь носили ОК линзы с обратной геометрией в течение 4-х, 8 ми, 16-ти и 24-х часов с не занимаемым вторым глазом для контроля. Измеренные центральная и периферическая толщины роговицы, а также ультраструктурные изменения роговичного эпителия, стромы и эндотелия в ответ на воздействие ОК линз.

Результаты: ОК значительно уменьшило толщину центрального участка роговицы во всех группах, за счет изменений в эпителии и строме. Значительное утолщение средне-периферического участка роговицы наблюдалось в группах 16-ти- и 24-х часового ношения, и также обусловлено изменениями в эпителии и строме. Гистологические результаты указывают, что в центральной роговице основным процессом стало сжатие клеток, что привело к укорочению крыловидных клеток и уплощению базальных клеток в большей степени, чем к их исчезновению или миграции. Перечисленные изменения не компрометировали структурную целостность демосом. Клеточные слои истонченного роговичного эпителия не изменены. Плоские клетки имеют большую площадь поверхности и овальное ядро вместо плоского. Это предполагает отсрочку отслойки старых клеток в истонченном эпителии средне-периферической области. Физическое наличие ОК линзы не наносило воздействия на эндотелий, микроструктуры микроворсинок и микроскладок, распределение коллагена.

Выводы: При кратковременном применении ОК линз с обратной геометрией роговица примата поддается быстрым изменениям в виде альтераций формы эпителиальных клеток. Предполагается, что роговица примата пластическая к физическому воздействию ОК линз.

Ортокератология [OK, также известная как рефракционная терапия роговицы (РТР)] - клинический метод временного уменьшения или устранения рефракционной ошибки с помощью изменения формы роговицы жесткими ОК линзами с обратной геометрией¹. Несколько исследований констатируют клиническую эффективность ОК, многочисленные топографические исследования показывают вызванное ОК линзами уплощение роговицы^2-5.

Перечисленные теории рефракционного влияния ОК рассматривают изменение передней поверхности роговицы (кривизны и толщины) и сгибания всей роговицы (воздействие на переднюю и заднюю кривизну). Сварбрик и ко. ² предположили, что изменение толщины роговицы сопровождалось ее истончением по центру и вероятно утолщением по периферии. Позже, Альхарби и Сварбрик ³ пришли к выводу, что ночная ОК приводит к быстрому истончению эпителия центрального участка роговицы и утолщению стромы в средней периферии. Следующее изменение сагиттальной высоты роговицы и является основным фактором рефракционного эффекта ОК.

Несмотря на большие клинические исследования, в том числе измерения топографических изменений толщины роговицы, влияние ОК линз на подлежащие ткани роговицы на микроскопическом уровне остается не рассмотренным. Образец человеческой роговицы получить невозможно, поэтому в данном случае лучшим объектом для изучения является животная модель.

Количество опытов на животных (кролики и коты) ^6,7, изучающих механизмы роговичных альтераций, становится все больше. Об изменениях в роговице, вызванных ОК линзами, выдвинуто несколько гипотез. В том числе: перераспределение эпителиальных клеток (общее уменьшение или увеличение клеточного слоя), компрессия эпителиальных клеток и движение межклеточной жидкости, изменение пролиферации базальных клеток, удержание клеток, альтерация отслойки поверхностных клеток и изменение формы стромы ^8,9.

Роговица примата состоит из трех основных слоев (эпителий, строма и эндотелий) и двух вспомогательных (Боуменова мембрана и Десцеметова оболочка). Сравнительные анатомические исследования показали, что роговица примата анатомически и гистологически наиболее подобна человеческой, особенно за счет Боуменовой мембраны ^{10, 11}, которая отсутствует в некоторых млекопитающих в т.ч. у кроликов ¹². Для этого опыта мы взяли приматов (Macaca fascicularis) вместо кроликов, поскольку приматы более всего подходят для изучения гистологических изменений в роговице, вызванных ОК линзами.

Клинически, частичного уменьшения силы преломления и уплощение центрального участка роговицы можно достичь уже за первые несколько часов применения ОК линз ^13-15. В данном исследовании рассматривались последовательные гистологические изменения в роговицах приматов, которые развивались в период кратковременного использования ОК линз (с интервалом ношение в 24 часа) на закрытых глазах.

Дискуссия: Изменения толщины роговицы, вызванные действием линз с обратной геометрией (RGL), у приматов подобные к изменениям, которые наблюдались при ночном применении ортокератологичних (OK) линз (с закрытыми глазами) у людей. Значительные изменения центральной толщины роговицы в этом исследовании появились в группы, которая носила линзы по 4 часа. Соответственно, в других группах, которые носили линзы дольше (по 8, 16, 24 часа), истончение центральной части роговицы также наблюдались. Данные результаты свидетельствуют, что применены в исследовании OK линзы особого дизайна достигли желаемого ортокератологичного эффекта у приматов, и они (линзы) подобные к линзам из клинических опытов. Наши исследования также коррелируют с исследованиями команды Чу и др. [Choo JD, Caroline PJ, Harlin DD, et al. Morphological changes in cat epithelium following overnight lens wear the Paragon CRT lens for corneal reshaping. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004, 45: 1552.], которые докладывают о значительном центральном истончение эпителия у котов при применении RGL (с закрытыми глазами) для коррекции миопии. Так же, исследования Матсубара и др. [Matsubara M, Kamei Y, Takeda S, et al. Histological and histochemical changes in rabbit cornea produced by an orthokeratology lens. Eye Contact Lens. 2004, 30: 198-204.] продемонстрировали значительное центральное истончение эпителия у кроликов при применении RGL (с закрытыми глазами).

Гистологические исследования показывают, что микроскопические изменения в роговице заметны при ночном применении OK линз с закрытыми глазами в течение как короткого срока (4 часа), так и обычного (8 часов) и длительных (16 и 24 часа) сроков. Основная реакция эпителия в центральном участке роговицы - скорее очаговое сжатия клеток (морфологическое изменение), чем их миграция или исчезновения слоев клеток. Из исследований контрольных групп, у приматов центральный участок роговицы занимают 7-8 слоев выстроенных различных эпителиальных клеток. Истончение центрального участка эпителия достигалось сокращением периферических клеток и уплощением центральных. Аналогичное наблюдение было и в исследованиях Чу и др. на кошках, где за 8 часов пользования OK линзами на закрытых глазах центральные клетки становились круглее по сравнению с обычной вытянутой формой.

В группах, которые носили линзы по 16 и 24 часа, выявлено значительное утолщение средне-периферического участка роговицы. Этот эффект был достигнут за счет изменений как в эпителии так и в строме (рассмотрено ниже). Опыты показывают, что у приматов, на которых применялись OK линзы по 16 и 24 часа, утолщение средне-периферического участка роговицы (16 часов = + 2,4%; 24 часа = + 3,7%) произошло за счет стромы (16 часов = + 1,02%, 24 часа = + 2,4%) и эпителия (16 часов = + 16,14%; 24 часа = + 16,98%). Участок утолщения соответствует средне-периферической зоне резервуара слезы, созданной более крутой вторичной кривизной RGL. Клинические исследования Алхабри и Сварбрика [Alharbi A, Swarbrick HA. The effects of overnight orthokeratology lens wear on corneal thickness. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003, 44: 2518-2523.] демонстрируют средне-периферическое утолщение стромы (2, 5%) в 18-ти человек, которые пользовались RGL с закрытыми глазами в течение трех месяцев. Наши результаты также коррелируют с исследованиями Чу и др. на кошках. В исследованиях Матсубара и др. на кроликах, что применяли RGL по 8 часов ежедневно в течение 28-ми дней, тоже замечено увеличение толщины роговицы в средне-периферической области.

В утолщенном эпителии базальные клетки имели удлиненную форму, ороговевшие клетки также увеличили площадь поверхности. Чу предполагает, что морфологические изменения базальных клеток могут быть обусловлены межклеточным транспортом цитоплазмы из центральных клеток к средне-периферических. Эпителиальные клетки соединены между собой мостиками, обеспечивающих межклеточную коммуникацию и молекулярный обмен [Bergmanson JPG. Light and electron microscopy. In: Efron N, ed. The Cornea: Its Examination in Contact Lens Practice. Oxford: Butterworth-Heinemann; 2001: 136-175.]. В этом исследовании обнаружены сжатые меньшие клетки по центру и удлиненные клетки по средней периферии. Несмотря на радикальные морфологические изменения, вертикально удлиненные клетки сохраняли порядок выстраивания и идеальный контакт с базальной мембраной. В то же время, в опытах Мастубары и др. на кроликах вертикально удлиненные клетки средне-периферического участка роговицы были расположены не регулярно (OK линзы носились ежедневно по 8 часов в течение 21-го дня). Такое гистологическое отличие может быть обусловлено разницей в продолжительности применения OK линз на роговицах животных.

Морфологические изменения у приматов поверхностных ороговевших клеток в зоне утолщенного средне-периферического эпителия является интересной находкой. Ежедневно роговичный эпителий обновляет поверхностные клетки: ороговевшие клетки постоянно отшелушиваются (десквамируются) в области перикорнеальной слезной пленки путем апоптоза и заменяются новыми клетками, которые пролиферируют с базальной мембраны. Пролиферируя в ороговевшие клетки, стволовые клетки базальной мембраны постоянно сплющиваются и увеличивают площадь поверхности [Gipson IK. Anatomy of the conjunctiva, cornea, and limbus. In: Smolin G, Thoft R, eds. The Cornea: Scientific Foundations and Clinical Practice. Boston: Little, Brown & Company; 1994: 3-24.]. Предыдущие исследования предполагали, что большая площадь поверхности поверхностных клеток у носителей контактных линз обусловлена отсроченным отшелушиванием [Lemp MA, Gold JB. The effects of extended-wear hydrophilic contact lenses on the human corneal epithelium. Ophthalmology. 1986; 101: 274-277.], [Lemp MA, Mathers WD, Sachdev MS. The effects of contact lens wear on the morphology of corneal surface cells in the human. Trans Am Ophthalmol Soc. 1990; 88: 313-325.] Из этого исследования, ороговевшие клетки средне-периферического утолщенного эпителия были большего размера и имели ядра овальной формы, или крупнее чем ядра обычных ороговевших клеток. Наличие этих больших старших поверхностных эпителиальных клеток доказывает задержку процесса десквамации. Мы считаем, что задержка отшелушивания ороговевшего эпителия способствует дальнейшему его росту и увеличению площади поверхности. Накопление слезы под более крутой вторичной или обратной кривизной OK линзы может изменять микросреду под линзой и тем самым задерживать отшелушивание клеток в слезу. Для точного определения частоты десквамации в утолщенном эпителию (клетки в минуту) необходимы дальнейшие исследования.

Исследования показали, что роговица начала заметно сплющиваться уже после первой ночи применения OK линз. Итак, роговица очень пластична к их действию. Такие мгновенные изменения были вызваны давлением линзы и веки, ночным отеком роговицы. Это истончение может приводить к нарушению целостности эпителиального барьера, что является основной защитой от патогенетических факторов из слезы. Поэтому, исследованию подлежали также стабилизирующие структуры эпителия - десмосомы (элементы межклеточной адгезии) [Bron AJ, Tripathi RC, Tripathi BJ. Wolff's Anatomy of the Eye and Orbit. London: Chapman & Hall; 1997]. Чу и др. [Choo JD, Caroline JD, Harlin DD. How does the cornea change under corneal reshaping contact lens? Eye Contact Lens. 2004, 30: 211-213.] предположили, что направленная сила (спереди - слеза и линза, сзади - строма) может разрушать межклеточные мостики и тем самым способствовать передвижению эпителия. Данный дефект приводит к изменению положения клеток или даже миграцию эпителия. Наши опыты показали, что даже во время длительных и существенных изменений формы эпителия роговицы количество и качество десмосом остается нормальной. Итак, десмосомы роговичного эпителия оказываются гибкими и эластичными и имеют очень прочную структуру. Таким образом, эластичность десмосом позволяет сплющивать крыловидные и базальные клетки без нарушения их структуры.

Эпителиальные клетки покрыты гликокаликсом - волокнистой мантией, сложившейся клеточными образованиями: микроворсинками и микроскладками эпителия [Gipson IK, Joyce NC. Anatomy and cell biology of the cornea, superficial limbus and conjunctiva. In: Albert DM, Jakobiec FA, Azar DT, et al., Eds. Principles and Practice of Ophthalmology. Philadelphia: WB Saunders; 2000: 612-629.]. Микроворсинки и микроскладки также создают систему поддержки устойчивого состава слезы и слизи, которые защищают роговицу. Комплекс клеточных образований, гликокаликсу, слезы и слизи образуют мощный барьер на пути инфекции глаза. Долман [Dohlman CH. The function of the corneal epithelium in health and disease. Invest Ophthalmol. 1971, 10: 383-407.] предположил, что микроворсинки и микроскладки также принимают участие в фиксации слезы на глазу вопреки гравитационным силам. В отличие от обычных линз, RGL оказывают давление на роговицу через слезную пленку. Поэтому, важно изучить изменения поверхностных структур эпителия в ответ на это давление. Из исследований следует, что OK линзы своим влиянием на поверхность роговицы не нарушают целостность этих поверхностных структур. Несомненно, вопрос влияния OK линз на клеточные образования эпителия требует дальнейших исследований методом зеркальной микроскопии.

Исследования показали, что центральное истончение роговицы сопровождается истончением стромы во всех группах, и дополнительно утолщением средне-периферической стромы в группах, которые носили линзы по 16 и 24 часа. Из этого следует, что за одну ночь OK линзы могут повлиять на давление слезной пленки и тем самым привести к изменениям в строме. Рассмотрены RGL имеют плоскую центральную оптическую зону 6,0-6,5 мм в диаметре, окруженную более крутой второй кривизной (обратная кривизна). Периферическая часть линзы обеспечивает лучшее прилегание к средне-периферической и периферической участков роговицы. Этот дизайн помогает сохранять центральное положение линзы и обеспечивает разное давление слезной пленки в разных участках линзы. RGL оказывает положительное давление на роговицу в центральной плоской области, а вторая кривизна вызывает отрицательное давление в средне-периферической зоне и оттягивает на себя слезу. Слеза распределяется неодинаково и оказывает разное давление на роговицу, чем может быть обусловлен эффект «составления» центрального участка роговицы и истончение центральной стромы. Тем не менее, электронная микроскопия показала, что коллагеновые волокна распространенные равномерно во всех исследованных роговицах и в передней и задней частях стромы. В то же время, в воспаленной строме волокна коллагена находились не в одинаковых количествах в коллагеновых ламелах и интраламелярных озерах аморфной жидкости (по исследованиям Едельхаусера и др. [ Edelhauser HF, Geroski DH, Ubels JL. Physiology. In: Smolin G, Thoft R, eds. The Cornea: Scientific Foundations and Clinical Practice. Boston: Little, Brown & Company; 1994: 25-46]). Итак, кратковременное применение OK линз не вызывает воспаление роговицы. Но вопрос конечного механизма истончения и утолщения стромы в этом исследовании остается не решенным.

Роговичный эндотелий - это расположенный на задней поверхности роговицы монослой плоских специализированных клеток, богатых на митохондрии [Iwamoto T, Smelser GK. Electron microscopy of the human corneal endothelium with reference to transport mechanisms. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1965; 4: 270-284.]. Этот слой обеспечивает состояние легкой дегидратации роговицы регулируя транспорт жидкостей и солей через ее заднюю поверхность сквозь плотные (zonulae occludentes) и промежуточные связи. Плотные связи расположены на конечных участках латеральных мембран клеток, связывая и наполняя межклеточное пространство [McLaughlin BJ, Caldwell RB, Sasaki Y, et al. Freeze-fracture quantitative comparison of rab], [Hirsch M, Renard G, Faure JP, et al. Study of the ultrastructure of the rabbit corneal endothelium by the freeze-fracture technique: apical and lateral junctions. Exp Eye Res. 1977, 25: 277-288.]. Однако, эти связи не окружают клетки полностью, поэтому жидкость из передней камеры глаза может попадать в относительно дегидратированную роговицу. Промежуточные связи находятся по всей поверхности латеральной плазмы и имеют специфическую пентиламинарну структуру. Они сужают участки межклеточного пространства с 25-45 до 3 нм [Leuneberger PM. Lanthanum hydroxide tracer studies on rat corneal endothelium. Exp Eye Res. 1973, 15: 85-91], [Kreutziger GO. Lateral membrane morphology and gap junction structure in rabbit corneal endothelium. Exp Eye Res. 1976, 23: 385-393]. Суженные межклеточные промежутки направляют жидкостный ток до соединенных латеральных мембран и тем самым предотвращают чрезмерную циркуляцию жидкости в эндотелии и отека стромы.

В данном исследовании приматы носили RGL с высоким Dk с закрытыми глазами. Плоские жесткие контактные линзы создают OK эффект механически давя на центральный участок роговицы. Такое вторжение может иметь негативный эффект на метаболизм роговицы и повредить целостность эндотелия, что приведет к быстрому отеку роговицы. Электронная микроскопия выявила структуры роговичного эндотелия, в том числе компоненты межклеточных связей (zonulae occludens, zonulae adherens и промежуточные связи), в хорошем состоянии. Плотные связи сохранили свои размеры и количество. Промежуточные связи также найдены на всех уровнях соединенных латеральных мембран. Между соседними эндотелиальными клетками наблюдались как обычные так и суженные участки межклеточного пространства. Данные находки позволяют предположить, что кратковременное ночное применение ОК линз не влияет на межклеточные связи эндотелия и не нарушают водопроницаемый барьер роговицы. Эти результаты наблюдений совпадают с результатами работы Хираока и др. [Hiraoka T, Furuya A, Matsumoto Y, et al. Influence of overnight orthokeratology on corneal endothelium. Cornea. 2004; 23 (Suppl 1): S82-S86.], которая демонстрирует отсутствие влияния годового использования RGL с высоким Dk на количество, размер и форму эндотелиальных клеток роговицы. Это может быть обусловлено высокой кислородной проницаемостью примененных линз.

В заключении, исследование показало, что кратковременное применение RGL оказывает стремительные и значительные гистомофрометрические изменения в роговице приматов. В частности в роговичном эпителии происходят быстрые альтерации. Наблюдалось укорочение базальных и крыловидных клеток, что приводило к тотальному уплощению центрального эпителия. Также выявлено утолщение средне-периферического участка роговицы, которое сопровождалось увеличением размера поверхностных клеток. Такие результаты позволяют предположить, что роговичный эпителий легко подвергается физическому воздействию ОК линз и альтерирует на микроскопическом уровне. Эти краткосрочные опыты на приматах коррелируют с результатами использования ОК линз людьми. Однако, толщина роговицы может значительно варьироваться в процессе ее подготовки к микроскопии, особенно на этапе иссечения, что значительно ограничивает результативность такой микроскопии.